X-Gal與X-α-gal可以互相替換嗎？X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反應(yīng)底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反應(yīng)底物。X-α-gal用作酵母雙雜交系統(tǒng)中藍(lán)白篩選的篩選標(biāo)記。二者不可以互相替換。

X-α-Gal檢測(cè)酵母MEL1基因的激活。MEL1是GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)報(bào)告基因，編碼分泌型的α-半乳糖苷酶。該酶可水解無色的X-α-Gal底物并最終產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。表達(dá)α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培養(yǎng)基上顯藍(lán)色，即陽(yáng)性的雙雜交作用。X-α-Gal可在培養(yǎng)基上直接檢測(cè)酵母雙雜交相互作用，利用此底物可以省去雙雜交體系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays；

X-Gal用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶（LacZ）的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母細(xì)胞后通過加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays才能進(jìn)行顯色。因此操作流程相對(duì)繁瑣。

攜帶MEL1基因的酵母菌株：Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A

1. X-α-gal 使用方法

一、涂布于預(yù)制平板：

1）溶解24 mg X-α-gal于6 mL DMF，終濃度為4 mg/ mL。

2）涂布200 μL(15 cm) 或者100 μL（10 cm）X-α-gal 儲(chǔ)存液于預(yù)制平板上；

3）置于37℃培養(yǎng)箱至液體被吸收（由于DMF揮發(fā)性低，最長(zhǎng)可放4小時(shí)）；

4） 將轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母涂于平板上，于37℃或30℃培養(yǎng)直至藍(lán)色菌落出現(xiàn)。

二、直接加入瓊脂中：

1）溶解60 mg X-α-gal于3 mL DMF，終濃度為20 mg/ mL。

2）將已滅菌瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50-55 ℃；

3）向上述培養(yǎng)基中加入20 mg/ mL X-α-Gal，比例為每升培養(yǎng)基中加入1 mL X-α-Gal溶液。

2. X-gal使用方法（filter-lift assays）

試劑準(zhǔn)備

• Z buffer

        16.1 g/L      Na2HPO4 · 7H2O  

         5.50 g/L      NaH2PO4· H2O     

         0.75 g/L      KCl                        

         0.246 g/L    MgSO4· 7H2O       

       調(diào)節(jié)pH 7.0，高溫高壓滅菌。可室溫保存。

20 mg/mL X-gal 儲(chǔ)液（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside），溶于DMF，保存于-20。
 

• Z緩沖液/X-gal 溶液

         100 mL       Z buffer

         1.67 mL     X-gal 儲(chǔ)液

         0.27 mL      β-mercaptoethanol

實(shí)驗(yàn)流程

1. 生長(zhǎng)2-4天的新鮮單菌落; 用鉛筆在濾紙上 畫 8×8 的方格，每個(gè)方格放置一個(gè)新鮮培養(yǎng)的單菌落并記錄下編號(hào);

2. 配制 Z buffer/X-gal 反應(yīng)液;

3. 在干凈平皿中鋪一張濾紙，用 Z buffer/X-gal 反應(yīng)液(2.5-5 mL)將濾紙浸濕;

4. 用鑷子另取一張無菌、干燥的濾紙，鋪在劃線培養(yǎng)的酵母菌表面，用鑷子輕輕滾壓，使菌轉(zhuǎn)移到濾紙表面(注:在濾紙上做好方位標(biāo)記，以便識(shí)別菌種編號(hào));

5. 當(dāng)濾紙全部濕潤(rùn)，用鑷子將鋪有菌落的濾紙放入液氮中速凍 30 sec，液氮需沒過菌落;

6. 取出濾紙，放置于一干凈平皿中使其室溫解凍;

7. 用鑷子將解凍的濾紙輕輕疊放在浸有反應(yīng)液的濾紙上(有菌的表面朝上)，保證兩層濾紙間沒有氣泡;30°C，培養(yǎng)8 h，觀察X-gal染色情況。菌落變 為藍(lán)色的為陽(yáng)性，超過 8 h 變藍(lán)，很有能是假陽(yáng)性。

注意事項(xiàng)：

1. x-gal注意遮光保存。

2. 液氮冰凍菌的時(shí)候可以試試反復(fù)凍融，這樣會(huì)使細(xì)胞破碎的更加完全一些，便于染色液的滲透。